發(fā)光細(xì)菌法對(duì)水質(zhì)毒性檢測(cè)的研究和應(yīng)用

   發(fā)光細(xì)菌法(Microtox)是環(huán)境樣品毒性檢測(cè)的生物測(cè)試技術(shù)，并已被列入德國國家標(biāo)準(zhǔn)(DIN38412)和標(biāo)準(zhǔn)(ISO11348)。毒性是一項(xiàng)綜合的生物學(xué)參數(shù)，它是衡量樣品對(duì)活性生物體所產(chǎn)生的影響，不能以化學(xué)分析的方法進(jìn)行測(cè)定，而其他的生物測(cè)試方法如魚類試驗(yàn)、浮游動(dòng)物試驗(yàn)、藻類試驗(yàn)等則較為復(fù)雜，且必須使用高等生物進(jìn)行試驗(yàn)，從而引起眾多的爭(zhēng)議。發(fā)光細(xì)菌測(cè)試使用了具有發(fā)光特性的天然微生物，而毒性物質(zhì)則將抑制起發(fā)光，且毒性越強(qiáng)光抑制越明顯，這一方法經(jīng)研究被證實(shí)具有快速、簡便的特點(diǎn)，同時(shí)有很好的靈敏度和可靠性。另外，發(fā)光細(xì)菌本身沒有危害性。

發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)的整個(gè)過程在60分鐘之內(nèi)，發(fā)光抑制率通過測(cè)定起始和終止?fàn)顟B(tài)時(shí)的細(xì)菌發(fā)光值并計(jì)算得到，測(cè)試的結(jié)果有如下兩種：

l光抑制率，通過計(jì)算直接測(cè)定樣品的毒性

l稀釋因子GL，在DIN的分析中，將樣品稀釋成系列濃度并測(cè)定每個(gè)稀釋濃度的抑制率，其中造成20%或20%以下抑制率的樣品稀釋度即為GL

德國政府的相關(guān)法規(guī)及應(yīng)用

化學(xué)工業(yè)的廢水、填埋場(chǎng)滲出液和工業(yè)冷卻水必須通過發(fā)光細(xì)菌的毒性測(cè)試。同時(shí)，德國聯(lián)邦環(huán)境部門正在起草制定合適的指導(dǎo)性技術(shù)，從而對(duì)其他的工業(yè)部門進(jìn)行監(jiān)督。發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)是取代魚類毒性試驗(yàn)的方法之一，并且已在Bavarian地區(qū)進(jìn)行了試點(diǎn)。

德國水管理法(WHG)規(guī)定對(duì)填埋廠滲出液和工業(yè)冷卻水進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試，這些廢水的毒性將造成嚴(yán)重的問題，如生物污水處理系統(tǒng)和地表水的破壞，因此，WHG明確規(guī)定了廢水排放的毒性限制：

l填埋場(chǎng)滲出液經(jīng)常具有較嚴(yán)重的污染，GL=4

l工業(yè)冷卻水的污染部分是由于生物殺滅劑，GL=12

l現(xiàn)在起，化學(xué)工業(yè)的廢水也被規(guī)定進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)定，GL=32

廢水監(jiān)測(cè)的目標(biāo)是含蓋90%以上的部門，包括醫(yī)院廢水（其中被發(fā)現(xiàn)存在毒素），大量使用清潔劑和表面活性劑的部門（如食品和飲料業(yè)），石油工業(yè)等。根據(jù)WHG的規(guī)定，必須對(duì)20個(gè)以上的部門所排放的廢水以魚類試驗(yàn)進(jìn)行毒性監(jiān)測(cè)，Bavaria地區(qū)于1993年起采用了發(fā)光細(xì)菌和Daphania的試驗(yàn)代替魚類試驗(yàn)，該模式現(xiàn)在已被全德國所接受，其結(jié)果等同于魚類試驗(yàn)。在魚類試驗(yàn)、浮游動(dòng)物試驗(yàn)、藻類試驗(yàn)和發(fā)光細(xì)菌的毒性測(cè)試比較中，發(fā)光細(xì)菌法為敏感，被測(cè)出毒性的廢水比例高。

表1. 不同工業(yè)部門發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)的規(guī)定（德國聯(lián)邦環(huán)境辦公室，1998）

GX: 稀釋因子，樣品不產(chǎn)生毒性效應(yīng)的

GF: 魚類試驗(yàn)，GD: daphania試驗(yàn)，GA: 藻類試驗(yàn)，GL: 發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)

歐盟和美國的相關(guān)政府指導(dǎo)性文件：

歐盟關(guān)于邊界河流水質(zhì)控制的指導(dǎo)性文件：

由于毒性物質(zhì)排放所造成的污染，所以需通過生物試驗(yàn)對(duì)環(huán)境水樣、沉積物、流出物進(jìn)行毒性測(cè)定，從而為環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的安全提供早期的預(yù)警。環(huán)境樣品毒性測(cè)定所選用的方法所要考慮的因素包括：方法的靈敏度、快速性，方法要能覆蓋較廣范圍的化學(xué)毒性物質(zhì)。其所列出的排放物、環(huán)境水、沉積物的毒性測(cè)試方法包括發(fā)光細(xì)菌法(Microtox)、浮游生物(D.magna)、藻類、魚類試驗(yàn)等，其中Microtox方法的特點(diǎn)是反應(yīng)快速、操作簡便。

美國環(huán)保局(EPA)全廢水毒性試驗(yàn)：污染物測(cè)定程序的指導(dǎo)性文件：

EPA對(duì)于排放物的控制的經(jīng)典方法是實(shí)行對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)的指標(biāo)限制，但是在實(shí)際的環(huán)境樣品中人仍存在很多未知的化合物，另外，化合物的毒性效應(yīng)是所有組成物質(zhì)拮抗作用或抑制作用的綜合結(jié)果，所以單純的化學(xué)物質(zhì)的限定不能為水體的安全提供充分的保障。在此情況下，EPA和各州的環(huán)保局正開始使用生物學(xué)的方法對(duì)排放物的毒性進(jìn)行測(cè)定（而不是傳統(tǒng)的毒物的化學(xué)分析），從而終判定環(huán)境樣品的綜合毒性效應(yīng)。EPA在1994年所頒布的“全廢水毒性控制方案”即指出采用毒性指標(biāo)來控制通過NPDES程序的污染物的排放。方案指出，流出物的生物毒性檢測(cè)是水質(zhì)控制的重要方面。關(guān)于生物試驗(yàn)的方法，目前有魚類試驗(yàn)、浮游動(dòng)物試驗(yàn)等，雖然Microtox試驗(yàn)尚未列入正式的測(cè)試方法，但EPA已經(jīng)指出該方法可以作為一項(xiàng)毒性篩選試驗(yàn)，并且承認(rèn)其是一種有效的毒性檢測(cè)的工具。

使用發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行毒性檢測(cè)的原因：

發(fā)光作用是發(fā)光細(xì)菌正常生理狀態(tài)下所具有的性質(zhì)，它是細(xì)胞呼吸作用的副產(chǎn)物，而呼吸作用則是細(xì)胞和生物代謝的基本過程，細(xì)菌的發(fā)光直接和其呼吸相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞活性受到毒性物質(zhì)作用后，其活性將受到抑制，從而使呼吸速率下降，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)光降低，樣品的毒性越強(qiáng)，發(fā)光細(xì)菌的光損失越多，以細(xì)菌發(fā)光法測(cè)定樣品的毒性已經(jīng)被證明是一種方便、可靠的生物傳感方法。

Microtox急性毒性檢測(cè)系統(tǒng)概述：

該系統(tǒng)使用凍干的發(fā)光細(xì)菌制劑，通過15分鐘的暴露試驗(yàn)，測(cè)定其代謝的抑制情況，從而計(jì)算出樣品（水樣、土壤樣品）的毒性。該方法以通過工業(yè)、研究和政府的試驗(yàn)被證實(shí)有效，至今，已有超過500的關(guān)于Microtox系統(tǒng)應(yīng)用和評(píng)價(jià)的論文。同時(shí)該測(cè)試方法已在多個(gè)國家被認(rèn)可為*標(biāo)準(zhǔn)，包括ASTM(D-5660)。ISO11348-3（水質(zhì)測(cè)定—水樣對(duì)于發(fā)光細(xì)菌的抑制效應(yīng)測(cè)定）的草案也已經(jīng)得到批準(zhǔn)。加拿大已經(jīng)批準(zhǔn)該方法為常規(guī)的測(cè)試應(yīng)用于石油鉆井中的排水監(jiān)測(cè)。另外，這一方法已被提交美國環(huán)保局作為全廢水毒性測(cè)定(WET)的測(cè)試，從而作為國家污染和排放物減除系統(tǒng)(NPDES)中一項(xiàng)新方法。

Microtox試驗(yàn)的靈敏度：

目前，公開的數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)保存了1200種以上化學(xué)物質(zhì)的Microtox測(cè)試的EC50值。

Microtox試驗(yàn)的準(zhǔn)確性：

Microtox試驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行了充分的重復(fù)性試驗(yàn)，包括實(shí)驗(yàn)室間的比較，證實(shí)其變異系數(shù)在20%以內(nèi)，與化學(xué)分析方法類似，明顯優(yōu)于其他生物學(xué)測(cè)試。

Microtox試驗(yàn)的應(yīng)用：

該方法已廣泛、成功地應(yīng)用于環(huán)境和過程的監(jiān)測(cè)，具體包括：

l污水處理場(chǎng)的流入液的檢測(cè)，以保護(hù)活性污泥的生物活性；

l污水處理廠的流出液的檢測(cè)，以保護(hù)受納水體的安全；

l毒性減低評(píng)價(jià)(TRE’s)和毒性鑒定評(píng)價(jià)(TIE’s)；

l表層水的監(jiān)測(cè)以確定點(diǎn)源污染和非點(diǎn)源污染；

l生飲水的檢測(cè)；

l沉淀物的測(cè)定；

l土壤污染的檢測(cè)及其恢復(fù)過程的監(jiān)測(cè)；

l工業(yè)過程中水體中生物殺滅劑的檢測(cè)

關(guān)于使用Microtox試驗(yàn)進(jìn)行飲用水監(jiān)測(cè)的情況：

使用Microtox試驗(yàn)監(jiān)測(cè)飲用水的原因：

   Microtox試驗(yàn)是建立在生物傳感器基礎(chǔ)上的毒性檢測(cè)系統(tǒng)，它能有效地檢測(cè)突發(fā)性或破壞性的水源污染，已有多個(gè)國家將該系統(tǒng)應(yīng)用于飲用水的監(jiān)測(cè)。在美國，城市中偶發(fā)的和蓄意性的污染特別引起關(guān)注，本方法可以在15分鐘內(nèi)快速地完成檢測(cè)，從而對(duì)水質(zhì)的變化作出迅速的反應(yīng)，另外，Microtox試驗(yàn)快速篩選結(jié)果的可靠性及其操作的簡便性、成本的合理性也使之成為重要點(diǎn)源上水質(zhì)的常規(guī)監(jiān)測(cè)的有效手段。

Microtox試驗(yàn)對(duì)特定情況下的飲用水的檢測(cè)：

美國*的供水系統(tǒng)和華盛頓地區(qū)的供水管道都使用該檢測(cè)方法對(duì)飲用水進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而保護(hù)平民和軍事人員免受引水污染的危害。

1984年洛山磯和1996年亞特蘭大奧運(yùn)會(huì)期間、1991年海灣戰(zhàn)爭(zhēng)以及2000年民主黨全國代表大會(huì)期間都采用了該方法對(duì)飲用水的處理和分配系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測(cè)，以保證飲水的安全。

Microtox試驗(yàn)的檢測(cè)范圍：

經(jīng)過近20年的科學(xué)研究，已經(jīng)證明該方法對(duì)數(shù)千中不同類型的化學(xué)物質(zhì)具有敏感的效應(yīng)，其反應(yīng)的毒性物質(zhì)包括重金屬、農(nóng)藥、真菌殺滅劑、殺鼠劑、有機(jī)溶劑、工業(yè)化合物等。

下表列出了部分毒性物質(zhì)及其Microtox試驗(yàn)的檢測(cè)限

不使用直接化學(xué)分析的原因：

   對(duì)于綜合性樣品的處理研究表明，特異性化學(xué)分析測(cè)定未知樣品的毒性僅占毒性檢測(cè)的20%，化學(xué)分析雖然靈敏、準(zhǔn)確，但由于時(shí)間、費(fèi)用以及對(duì)樣品的不可知性使其在毒性的實(shí)際篩選中受到很大限制，另外，混合樣品中不同的化合物彼此之間存在著協(xié)同或拮抗作用，所以終的毒性作用并非單一物質(zhì)作用的加減，因此必須使用生物方法對(duì)綜合的毒性效應(yīng)（尤其對(duì)于未知物）進(jìn)行測(cè)定。目前所應(yīng)用的生物檢測(cè)主要包括：魚類試驗(yàn)、藻類試驗(yàn)、D.magna試驗(yàn)和Microtox試驗(yàn)，前三種試驗(yàn)周期長、操作復(fù)雜，而Microtox試驗(yàn)解決了上述問題，并且數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性也明顯提高。

測(cè)試儀器的簡便性：

   Microtox試驗(yàn)所使用的儀器小巧，便于攜帶，可用于實(shí)驗(yàn)室研究和分析，同時(shí)也可在現(xiàn)場(chǎng)或野外進(jìn)行原位即時(shí)的監(jiān)測(cè)。

發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)的原理：

發(fā)光細(xì)菌體內(nèi)的熒光素酶催化熒光素的氧化作用，反應(yīng)如下：

FMNH2+O2+R-CO-H→FMN+R-COOH+H2O+Light

從而產(chǎn)生生物發(fā)光，它直接與細(xì)胞的活性及代謝狀況相關(guān)。毒性物質(zhì)將改變細(xì)胞的狀態(tài)，包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、電子的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、酶及細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這些變化終將導(dǎo)致生物發(fā)光的減弱。通過生物發(fā)光光強(qiáng)的測(cè)定即可計(jì)算得到樣品毒性的強(qiáng)弱。

Modern Water公司microtox檢測(cè)系統(tǒng)

使用活體生物的檢測(cè)技術(shù)是測(cè)定水樣和土壤樣品所存在和潛在毒性的*可靠的方法，Modern Water經(jīng)過多年的發(fā)展與改進(jìn)，在生物毒性試驗(yàn)和儀器準(zhǔn)確性結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展了生物毒性檢測(cè)系統(tǒng)，使Microtox檢測(cè)系統(tǒng)變得更加便攜，。

發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)近期研究論文：

Microtox試驗(yàn)作為一種新的有效的醫(yī)療儀器和器材的安全檢測(cè)方法。

J Biomater Appl 1998 Oct; 13(2): 166-171

城市地下水質(zhì)量快速生物檢測(cè)方法的比較，生物檢測(cè)能準(zhǔn)確、有效地測(cè)定環(huán)境對(duì)地下水的毒性影響，而Microtox試驗(yàn)較之D. magna試驗(yàn)具有更好的重復(fù)性。

Chemosphere 2002 May; 47(5): 547-54

廢水毒性的評(píng)價(jià)：Microtox試驗(yàn)和活性污泥氧吸收抑制試驗(yàn)的比較，Microtox試驗(yàn)具有很高的靈敏度，是測(cè)定污水處理廠廢水毒性的有效工具。

Water Res 2002 Feb;36(4): 919-24

應(yīng)用Microtox試驗(yàn)檢測(cè)Albufera國家公園的水質(zhì)毒性

Chemosphere 2002 Jan;46(2): 355-69

檢測(cè)藥物在水中的毒性，首先使用Microtox試驗(yàn)對(duì)不同的藥劑進(jìn)行毒性試驗(yàn)

J Chromatogr A 2001 Dec 14;938(1-2):187-97

三種商品化生物發(fā)光毒性檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)化學(xué)毒性的測(cè)定

Water Res 2001 Oct;35(14):3448-56

運(yùn)用生物發(fā)光毒性檢測(cè)技術(shù)對(duì)石油污染的土壤進(jìn)行生態(tài)危害評(píng)價(jià)

Environ Toxicol Chem 2001 Jul;20(7):1438-49

金屬工廠廢水毒性測(cè)定方法的比較，Microtox試驗(yàn)和魚類試驗(yàn)

兩者具有很好的相關(guān)性，而Microtox試驗(yàn)更適合于工業(yè)廢水的監(jiān)測(cè)

Environ Toxicol 2001;16(2)136-41

Microtox試驗(yàn)對(duì)于有機(jī)磷殺蟲劑及其代謝產(chǎn)物毒性的研究

Aq. Tox. 1994: 30(3):259-270

發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)研究報(bào)告：

   美國能源部Los Alamos實(shí)驗(yàn)室(LANL)使用Microtox試驗(yàn)對(duì)特殊的含放射性物質(zhì)的污水排放物進(jìn)行原位的快速監(jiān)測(cè)，結(jié)果也證明了該方法的靈敏、快速以及分析成本較低、操作簡便。

   法國環(huán)境科學(xué)中心毒理實(shí)驗(yàn)室對(duì)Microtox試驗(yàn)和D.magna試驗(yàn)進(jìn)行了比較，對(duì)39種化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩者的一致率達(dá)86%，而Microtox試驗(yàn)更為方便，更適合對(duì)工業(yè)排放物進(jìn)行毒性篩選。

   瑞士實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明，Microtox試驗(yàn)?zāi)軌蚝芎玫販y(cè)定土壤中殘留的農(nóng)藥及其主要代謝產(chǎn)物的毒性。

   科威特地球環(huán)境科學(xué)研究部門的環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用Microtox試驗(yàn)對(duì)排放入Shuaiba灣的工業(yè)廢水對(duì)海水所造成的毒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)部分樣品產(chǎn)生中等的毒性效應(yīng)，并有季節(jié)性的變化。

   荷蘭阿姆斯特丹的Omegam環(huán)境研究所運(yùn)用Microtox試驗(yàn)等的毒性實(shí)驗(yàn)方法對(duì)阿姆斯特丹地區(qū)9個(gè)淡水系統(tǒng)的沉積物的孔隙水(pore water)進(jìn)行毒性檢測(cè)研究，其中3個(gè)根據(jù)荷蘭污染控制法的規(guī)定要求存在較嚴(yán)重的污染。

   香港科技大學(xué)生物研究中心運(yùn)用Microtox試驗(yàn)對(duì)維多利亞港的海水沉積物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其中部分樣品存在重金屬污染所造成的毒性。

   意大利米蘭的水研究所使用Microtox試驗(yàn)對(duì)意北部的Orta湖的沉積物進(jìn)行了毒性研究，發(fā)現(xiàn)人造纖維工廠附近的區(qū)域由于銅和氨的排放，孔隙水中有較明顯的毒性。

   密歇根大學(xué)的研究人員應(yīng)用Microtox試驗(yàn)、D.megna試驗(yàn)和Chironomus tentans試驗(yàn)對(duì)底特律河的沉積物的毒性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示Microtox試驗(yàn)的時(shí)間短也為敏感。

   巴爾第摩水與廢水局面對(duì)隨時(shí)可能的毒性物質(zhì)的超標(biāo)排放，開始執(zhí)行排放物的毒性控制以保證水質(zhì)，毒性排放監(jiān)測(cè)的方法中即包括了Microtox試驗(yàn)。

   西班牙農(nóng)業(yè)部門的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境水體中包含了很多未知的組成物質(zhì)，其效應(yīng)是多種因素的綜合作用，因此其對(duì)環(huán)境的危害性影響的判別很復(fù)雜，而Microtox試驗(yàn)是對(duì)混合樣品的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)的很好工具。

   荷蘭的公共健康和環(huán)境保護(hù)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用Microtox試驗(yàn)對(duì)萊茵河的河水進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，由于試驗(yàn)只需15分鐘，因此如發(fā)現(xiàn)毒性問題，可立即采取措施，是河水在進(jìn)入荷蘭后其毒性物質(zhì)和作用逐步降低。

   美國環(huán)保局的一項(xiàng)研究報(bào)告指出，暴風(fēng)雨引起的污水存在一定的毒性，使用Microtox試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行的研究表明，9%的暴風(fēng)雨污水(stormwater)經(jīng)分析具有顯著的毒性效應(yīng)。

   以色列的研究人員的研究結(jié)果認(rèn)為Microtox試驗(yàn)由于其經(jīng)濟(jì)性和管理操作的可行性，因此是工業(yè)園區(qū)污染源監(jiān)控處理的一種有效工具。

   美國的研究發(fā)現(xiàn)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)除了營養(yǎng)物質(zhì)以外還包含了許多毒性化學(xué)物質(zhì)，通過發(fā)光細(xì)菌的毒性試驗(yàn)可以快速地發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場(chǎng)排放和滲出液中所存在的毒性。

   美國海洋資源部門對(duì)船塢滲出液的研究發(fā)現(xiàn)木材防腐劑存在著毒性作用(Microtox試驗(yàn))，從而對(duì)河口水環(huán)境造成污染。

   在水質(zhì)監(jiān)測(cè)分析方面，發(fā)光細(xì)菌法(Microtox)以其快速篩選，結(jié)果的可靠性及其操作的簡便性、成本的合理性等優(yōu)點(diǎn)，必將為水質(zhì)的監(jiān)測(cè)，帶來便利以及更美好的前景。

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